محلول سازی نمونه ها برای الکتروفورز 2 بعدی
در نظر گرفتن ماهیت نمونه ، در انتخاب راهکار مناسب برای محلول ساختن پروتئینهای موجود در نمونه بسیار مهم است . در صورتیکه نمونه مورد نظر از منابع سلولی یا بافتی استخراج شود ، اولین قدم لیز سلولها و خارج کردن محتوای پروتئینی آنهاست . روشهای متفاوت مکانیکی و شیمیایی در لیز و متلاشی ساختن سلولها به کار گرفته می شود. این روشها ممکن است ، روشهای ملایمی چون شکست دیواره سلول باکتریها توسط آنزیم لایزوزایم (Lysozyme) ، یا روشهای خشنی چون استفاده از پرس فرانسوی (French press) برای متلاشی ساختن سلولهای مخمری باشد .
به هر حال در روش مطلوب محلول سازی برای الکتروفورز دو بعدی باید تمام پیوندهای غیر کووالانت در کمپلکسهای پروتئینی ، شکسته شده و تجمع پروتئینی به پلی پپتیدهای منفرد و محلول تبدیل شوند . به علاوه روش محلول سازی باید اجازه خارج ساختن موادی نظیر نمکها ، لیپیدها ، پلی ساکاریدها و اسیدهای نوکلوئیک را که می توانند باعث اختلال در جدا سازی توسط الکتروفورز دو بعدی شوند ، به وجود آورد . در نهایت پروتئین ها ی نمونه باید در حین روند الکتروفورز دو بعدی ، محلول باقی بمانند . به همین دلایل محلول شدن نمونه یکی از عوامل بسیار حساس برای جداسازی پروتئینها توسط الکتروفورز 2 بعدی است .
روشهای متلاشی ساختن سلولها
روشهای متلاشی ساختن سلولها به منظور استخراج محتوای پروتئینی آنها ، دامنه وسیعی از روشهای فیزیکی و شیمیایی ملایم تا خشن را در بر می گیرد . ممکن است لیز سلولی به طور مستقیم در تماس با بافر محلول سازی صورت پذیرد یا در مواردی ممکن است از امواج مافوق صوت (Sonication) برای این منظور استفاده شود . حتی در برخی موارد ترکیبی از روشهای مختلف برای نیل به استخراج کامل پروتئین های نمونه استفاده می گردد .
متلاشی ساختن نمونه ها باید در سرما صورت پذیرد و نمونه مورد نظر در حین این روند باید روی یخ نگهداری شود . برای حفظ نمونه های پروتئینی از عملکرد پروتئاز های آزاد شده در حین متلاشی ساختن سلولها باید تمهیداتی در نظر گرفته شود . یکی از روشهای معمول متلاشی ساختن مستقیم سلولها در محلولهای لیز کننده ای است که سریعا پروتئاز ها و دیگر فعالیت های آنزیمی را متوقف کند . این محلولها عموما دارای مواد دناتوره کننده قدرتمندی هستند .
الف- روشهای متلاشی ساختن ملایم
این روشها معمولا زمانی به کار گرفته می شوند که نمونه مورد نظر حاوی سلولهایی است که به راحتی لیز می شوند ، سلولهایی نظیر سلولهای بافتی کشت داده شده ، سلولهای خونی و برخی از میکرو اورگانیسم ها . به علاوه از این روشها در مواردی هم که فقط تمرکز در بررسی یکی از اجزاء تحت سلولی است ، استفاده می شود . برای مثال می توان شرایطی را انتخاب کرد که فقط پروتئین های سیتو پلاسمیک آزاد شوند . یا میتوکندری های دست نخورده یا ارگانلهای دیگر توسط سانترفوژ تمایزی جدا شوند . برخی مواقع این روشها در ترکیب با یکدیگر استفاده می شوند . از روشهای ملایم متلاشی سازی سلولی می توان موارد زیر را نام برد .
1- لیز توسط دترجنت
دترجنت ها غشاء سلولی را حل می کنند و باعث لیز سلول و آزاد کردن محتوای آن می شوند . در بیشتر موارد سلولها مستقیما در بافر محلول سازی یا بافر خیساندن Rehydration Buffer لیز می شوند . چرا که این بافرها همیشه دارای دترجنت هستند . رایج ترین روش برای محلول سازی پروتئین ها در الکتروفورز 2 بعدی همان روشی است که در ابتدا توسط Farrell در سال 1975 شرح داده شده است . در این روش از اوره 9.5 M ، 4% دترجنت غیر یونی NP40 ، 1% ماده احیاء کننده دی تیو تریتول (DDT) و 2% آمفولایت (Ampholyte) در محدوده مناسب استفاده شده است که به آن اصطلاحا بافر لیز کننده (Lysis Buffer) می گویند . در حالی که این روش در بسیاری از انواع نمونه ها به خوبی نتیجه می دهد ، نمی توان از آن به طور گسترده ای استفاده کرد . چرا که محلول سازی پروتئین های غشایی چالش این روش است . دترجنت های دو یونی (Witterionic) ، مانند CHAPS ، در محلول سازی پروتئین های غشایی بسیار مؤثرند . به خصوص که با غلظت 4% و در ترکیبی با مخلوطی از تیواوره 2M و اوره 8M استفاده شود . دترجنتهای سولفوبتائین خطی نظیر SB3-10 یا SB3-12 نیز معرفهای حل کننده مؤثری هستند ، اما با غلظتهای بالای اوره سازگار نیست . این مسئله با استفاده از غلظت 2% این معرفها در ترکیب با اوره 1M و تیواوره 2M و CHAPS 2% برطرف شده است . دترجنت سدیم دودسیل سولفات SDS نیز قادر است واکنشهای پروتئینی غیر کووالانت را بشکند و معرف بسیار مؤثری در محلول سازی پروتئینهای غشایی است . اما خاصیت آنیونیک این ماده استفاده از آن را در IEF دچار مشکل می نماید . در هر صورت می توان از SDS به عنوان یک روش پیش محلول سازی ، در مورد نمونه هایی که قرار است الکتروفورز 2 بعدی گردند ، استفاده کرد . در این روش ابتدا نمونه در محلول 1% SDS حل می شود و بعد با محلول های حل کننده عادی مانند بافر لیز کننده رقیق می شود . در اینجا هدف خارج کردن SDS از پروتئین ها و جایگزینی آن با دترجنت های دو یونی یا غیر یونی است ، تا پروتئین ها در وضعیت محلول باقی بمانند . نسبت پروتئین به دترجنت دو یونی یا غیر یونی 1:3 و نسبت SDS به این دترجنتها 1:8 است و این نسبت ها باید به دقت کنترل گردند ، تا محلول سازی کاملا انجام شود و در عین حال اثرات مخرب SDS بر روی IEF به حداقل برسد .
2- لیز اسموزی
این روش در مواردی که نیاز به جدا سازی اجزاء تحت سلولی است به کار گرفته می شود . سلولهای خونی و سلولهای کشت بافتی به این روش پاسخ مطلوبی می دهند . در این روش سلولها در محلولی هیپواسموتیک Hyposmotic قرار داده می شوند .
3- لیز توسط یخ زدن و ذوب کردن (Freez-thaw lysis)
در این روش سلولها در یک یا چند نوبت متوالی به سرعت در نیتروژن مایع ، یخ زده می شوند و سپس ذوب می شوند .
4- لیز آنزیمی
دیواره سلولی در بافتهای گیاهی ، سلولهای باکتریایی و قارچی را می توان با استفاده از آنزیم اختصاصی برداشت . و سپس سلول را لیز کرد . لایزوزایم برای سلولهای باکتریایی ، سلولاز و پکتیناز برای سلولهای گیاهی ، و لایتیکاز برای مخمرها در یک محلول ایزواسموتیک حل شده و مورد استفاده قرار می گیرد .
ب- روشهای متلاشی ساختن خشن
سلولهای موجود در بافت ها و سلولهایی که دیواره سلولی مستحکمی دارند ، به سهولت متلاشی نمی شوند و باید از این روشها برای لیز آنها استفده کرد . باید در هنگام استفاده از این روشها ، از ایجاد حرارت و کف ممانعت کرد .
1- استفاده از امواج مافوق صوت
امواج صوتی تولید شده توسط یک سونیکاتور باعث لیز سلولها از طریق ایجاد برشهایی در دیواره سلولی می شوند . زمانیکه امواج مافوق صوت حداکثر تلاطم را در سیستم سلولی به وجود می آورند ، این برشها ایجاد می شوند .برای ممانعت از افزایش درجه حرارت سوسپانسیون سلولی و ایجاد کف ، ظرف سوسپانسیون سلولی در حمام یخ قرار داده می شود . و سونیکاسیون در مقاطع زمانی کوتاه مدت با فواصل زمانی معین صورت می پذیرد .
2- پرس فرانسوی
ایجاد پارگی در دیواره سلولی در این روش به دلیل گذر دادن سوسپانسیون سلولی از منفذی بسیار کوچک تحت فشار بسیار زیاد است . این روش بسیار ساده ، کارآمد و سریع است و معمولا برای میکرو اورگانیسم های دارای دیواره سلولی به کار برده می شود .
3- آسیاب کردن (Grinding)
برخی از مواقع از سیستم هاون دستی مخصوص برای آسیاب سوسپانسیون سلولی یا بافت ها استفاده می شود . برای این منظور قطعه بافتی مورد نظر سوسپانسیون سلولی در نیتروژن مایع یخ زده می شود و با این هاون سلولی پودر می شوند . می توان برای بهبود این روش به مخلوط در حال هاون شدن ، شن یا آلومینا (Al2O3) اضافه کرد .
4- هموژنیزه کردن
این روش ممکن است بصورت مکانیکی با کمک همزنهای برقی صورت گیرد که عموما برای نمونه های بافتی به کار گرفته می شود . استفاده از دانه های شیشه ای (Glass Bead) روش دیگر برای هموژنیزه کردن نمونه های سوسپانسیون سلولی است که با همزدن شدید سوسپانسیون حاوی این دانه ها ی شیشه ای در فواصل زمانی تکراری صورت می گیرد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
نظرات شما عزیزان:
|
روز بخير كاربر مهمان! 
